Činnost zahájila Galerie Rudolfinum v obnovených prostorách 1. ledna 1994. Za tuto nepříliš dlouhou dobu si již vytvořila pevnou pozici na naší výtvarné scéně. Svým zaměřením na současné výtvarné umění s občasnými exkurzemi do časově vzdálenějších období, hledáním nových a často nečekaných souvislostí v díle umělců již známých či přímo proslulých nebo výtvarníků mladých, případně dosud opomíjených, prezentací světové výtvarné scény v individuálních i kolektivních projektech Galerie Rudolfinum šťastně doplnila výstavní činnost dosavadního kulturního provozu nejen v Praze, ale i v celé České republice. Výlučná orientace na výstavy (galerie nemá vlastní sbírky), které jsou zároveň podkladem pro celou škálu dalších doprovodných programů, umožňuje dlouhodobě rozvíjet více hlavních dramaturgických témat. V současné době je v galerii k dispozici přibližně tisíc pět set čtverečních metrů výstavní plochy. Velkorysá architektonická koncepce výstavních sálů velké galerie osvětlených prosklenými stropy denním světlem byla v nedávné době doplněna o možnost zatemňování a dále o nejrůznější formy regulovatelného umělého osvětlení.

V Galerii Rudolfinum se setkává současné umění s historickou neorenesanční architekturou budovy Rudolfina. Propojení výtvarného umění s hudbou a dalšími uměleckými projevy skýtá možnost nevšedních kulturních zážitků.